案例类别：人工智能+跨学科融合
课程名称：药品质量管理工程 适用专业：药物制剂
开课学院：药学院 主讲教师：王晓斌
技术类型：虚拟筛选
应用场景：药物研发中的智能筛选
案例简介
创制应用效果更好、对非靶标生物选择性更强、对环境安全系数更高的绿色杀菌剂是解决当前农用菌害抗性问题的关键技术之一。琥珀酸脱氢酶（SDH）是位于真菌线粒体电子传递链上的一类膜蛋白复合物，其活力的强弱影响着真菌生存所需能量的获取和存储，是杀菌剂创制领域广受关注的靶标之一。2003年，巴斯夫将联苯结构引入酰胺骨架中，通过结构优化开发出了具有“里程碑”意义的啶酰菌胺，该类型琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs）其在农业生产中的成功应用拉开了广谱高效SDHIs创制的序幕。当前，基于优势片段联苯的优化和重塑已成为高效广谱SDHIs创制的热点和关键点，其中的一种尝试是将联苯尾端处的苯环去芳构化。鉴于此，申请人在吡唑酰胺SDHIs的疏水性尾链处引入了肟醚片段，设计了近千个杂环酰胺肟醚类衍生物。为提高目标化合物设计的精准度，减小合成的工作量，通过人工智能的方法从上述杂环酰胺肟醚类衍生物中筛选出24个潜在的SDHIs。然后，对上述筛选出的24个化合物进行合成、生物活性筛选以及作用机制的研究，验证了真菌体内的SDH为所构造目标分子的作用靶标。
一、背景
1.绿色杀菌剂创制的意义
粮食安全是关系到国民经济可持续发展和社会稳定的国家战略，是国家安全体系的重要内容。据统计，全世界每年有10亿吨左右的庄稼毁于病虫草害，由于病、虫、草、鼠害等造成的作物减产幅度超过20%，如果一旦停止用药或严重用药不当，一年后收成至少减少25%，两年后将减少不低于40%。根据我国农业部门的统计，我国病虫草害常年发生面积约60亿亩次，通过正确地使用农药，每年可挽回粮食480亿公斤以上、棉花6亿公斤、蔬菜4800万吨、水果600万吨，减少直接经济损失约800亿元。由此可见，农药在确保粮食安全方面发挥着不可替代的作用，使用农药是保证农业生产效益的最经济有效的手段。绿色农药创制是一项十分复杂的多学科交叉集成的系统工程，具有投资大、周期长、风险高的特点。据国际公认的统计数据，成功开发一种新农药，需要合成筛选约15.9万个化合物，耗资约2.86亿美元，从首次合成到进入市场平均历时11.5年。由此可见，基于传统随机筛选创制新农药的研究模式显然已无法适应当今时代的要求。只有不断吸收相关学科发展的最新成果，建立并发展全新的绿色农药分子设计研究体系，创制出综合性能更优异的绿色农药新品种，才能为我国农药工业和现代农业的高质量发展提供可持续的科技支撑。
2.人工智能在药物研发中的潜力
图1 当前人工智能技术在药物研发领域的应用
先导化合物的发现和优化是药物创制过程中最具挑战性的阶段，缺乏先导结构发现的关键技术也成为了新药研发成功率低的重要原因。先导化合物发现难的问题主要是因为化合物的化学空间非常大，可以达到10的60次方量级。同时先导物的筛选，优化和评价过程过于复杂。为了解决上述问题，整个创新药物发现需要一种全新的变革性的新模式。人工智能技术的出现彻底改变了正在改变药物发现的格局。在过去的几十年中，已经开发了一系列用于药物发现的人工智能模型。这些模型被广泛应用于发掘药物靶点、挖掘候选药物、高通量筛选、药物设计、药物合成、药物理化性质预测等方面，在新型药物先导结构的发现过程中发挥了极为重要的作用。
二、案例实施情况
图2 通过改造联苯优势单元获取的SDHIs
线粒体呼吸链上发生的电子转移能在细胞膜上产生一个至关重要的质子梯度，进而激活三磷酸腺苷（ATP）合成酶将二磷酸腺苷（ADP）转变为ATP。上述发生在线粒体中的氧化磷酸化为真核生物维持正常的生理和生化反应提供了必要的能量。作为线粒体呼吸链的关键组成部分，SDH在高效催化琥珀酸氧化的同时，亦能推动电子实现从琥珀酸到泛醌的转移。近半个世纪的实践证实，抑制植物病原真菌SDH的正常生理功能能极大程度地影响真菌生存所需能量的获取和存储，这使其成为杀菌剂创制领域广受关注的靶标之一。当前，已有25种酰胺类化合物因对真菌SDH具有优异的抑制效果而被成功开发为农用杀菌剂。2003年，巴斯夫将联苯结构引入酰胺骨架中，通过结构优化开发出了具有“里程碑”意义的SDHIs––啶酰菌胺。啶酰菌胺在农业生产中的成功应用拉开了广谱高效SDHIs创制的序幕，亦积极推动了世界各大农化公司对SDHIs的创制开发。啶酰菌胺高效广谱的抑菌特点得益于其分子中存在的联苯片段，这也成联苯吡菌胺、氟苯吡菌胺和联苯吡嗪菌胺成功开发的重要结构基础（结构如图2A所示）。
进入21世纪以来，基于优势片段联苯的优化和重塑已成为高效广谱SDHIs创制的热点和关键点，其中的一种尝试是将联苯尾端处的苯环去芳构化。这一方案在氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑环菌胺、苯并烯氟菌胺、氟茚唑菌胺和inpyrfluxam七个SDHIs的创制开发中有所体现（结构如图2B所示）。李圣坤等将啶酰菌胺疏水尾链处的4-氯苯基转变为非芳香性的噁唑啉单元，经结构优化后得到了化合物1，该化合物对水稻纹枯病菌和番茄灰霉病菌的离体抑制活性均优于啶酰菌胺；随后进行的活体药效试验表明，化合物1对灰霉病菌的抑制效果与啶酰菌胺保持相当。这些去芳构化得来的活性分子往往能很好地承继联苯类SDHIs的抑菌效果和抑菌谱。然而，在对SDHIs的抗性评估中发现，这些含有非芳香性尾链的SDHIs与联苯类SDHIs之间存在一定的交互抗性，例如由啶酰菌胺引发的抗药性菌株对吡噻菌胺亦表现出很强的非敏感性。
近年来，杨光富等通过基于靶标结构的虚拟筛选技术得到了一类含有二苯醚片段的吡唑甲酰胺先导骨架，经结构优化后发现了氯苯醚酰胺、氟苯醚酰胺和活性分子3（结构如图2C所示）。其中，氟苯醚酰胺已被应用于对纹枯病菌、灰霉病菌和白粉病菌等数十种病原真菌的田间防治，且这一杀菌剂与其它酰胺类SDHIs间未表现出明显的交互抗性。金洪等发现将联苯吡菌胺结构中的联苯片段转变为二苯胺结构后，所得化合物2对水稻纹枯病菌的田间防效可媲美对照药剂噻呋酰胺。由此可见，在联苯结构的两个苯环间加入适当的缓冲片段来打破联苯的刚性结构，可以使尾端处的苯环能灵活地进行构象调整来适应多样的活性腔结构。这一优势特性不仅使获得的活性分子有效避免了与其它SDHIs间的交互抗性，也使活性分子的抑菌谱得到了极大程度的扩展，因此是一种较为成功的优化策略。
图3 含肟醚结构的农用杀菌剂
肟醚片段通常由酮肟（醛肟）与卤代物的亲核反应制备得到，这不仅能实现分子局部片段极性由强向弱的转化，也能通过引入不同的酮肟（醛肟）和卤代物来探索基团体积、亲脂性、电负性等性质对生物活性的影响。正因如此，肟醚片段在杀菌剂的创制中有着重要的应用，据不完全统计先后共有14个结构中含有肟醚片段的分子被成功商品化（结构如图3所示）。值得注意的是，醚菌酯、苯氧菌胺、氟醚菌胺、醚菌胺、烯肟菌酯、烯肟菌胺、肟醚菌胺和肟菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的作用位点是线粒体复合物III，这也在某种程度上暗示肟醚片段在线粒体复合物抑制剂的创制过程中存在加以利用的可能性。与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂相似，具有吡唑甲酰胺片段的SDHIs的作用位点同样位于线粒体膜上，因此在甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的创制中应用广泛的肟醚片段同样能在新型SDHIs的创制过程中有所应用。
图4 琥珀酸脱氢酶抑制剂的分子模型
鉴于上述分析，本文在吡唑酰胺SDHIs的疏水性尾链处引入了肟醚片段（图4），设计了近千个结构新颖的杂环酰胺肟醚类衍生物。为提高目标化合物设计的精准度，减小合成的工作量，首先采用FungiPAD（http://chemyang.ccnu.edu.cn/ccb/database/ FungiPAD/）开源平台对所设计的目标分子的类药性进行了筛选以减少化合物的合成数量。FungiPAD开源平台通过比较未知化合物与已商品化农用杀菌剂的物理化学性质，定量预测未知化合物的类药性，以指导农用杀菌剂分子的工具。RDL、QEF和GAU是FungiPAD开源平台定量评价化合物类药性所用到的三个重要参数，当其数值分别达到或超过1.210、0.380和4.620时，意味着未知化合物具有较理想的农用杀菌剂类药性。随后，采用AutoDock和Vina软件对初步符合类药性的分子与琥珀酸脱氢酶（PDB number: 2FBW）进行分子对接，通过对接结果的构型分析确定目标分子与蛋白之间的结合能，最终得到了24个可能对琥珀酸脱氢酶具有良好抑制作用的吡唑酰胺肟醚类分子。上述24个目标分子的具体信息总结在表1中。
表1 拟合成目标分子的虚拟筛选信息
图5 目标分子E1杀菌剂类药性分析
以商品化药剂啶酰菌胺为阳性对照，采用菌丝生长速度法测试了目标化合物在50 μg/mL浓度下对水稻纹枯病菌、番茄灰霉病菌和小麦赤霉病菌的抑制作用，测试结果总结在表2中。目标分子E7、E21和E24在50 μg/mL时对番茄灰霉病菌的抑制率分别为63.64、66.47和52.24%。同时，化合物E18–E22和E24在50 μg/mL时对小麦赤霉病菌的抑制率分别达到了70.83、68.54、65.63、69.83、69.42和60.83%。目标分子在50 μg/mL时对水稻纹枯病菌的选择性抑制是最引人注意的，其中分子E1–E6、E9、E10、E13–E15、E20和E23对水稻纹枯病菌的抑制率超过了80%。进一步的抑菌活性测试发现，目标分子E1、E2、E4、E5、E6、E8和E9对水稻纹枯病菌的EC50值分别达到了1.14、1.74、1.40、1.74、1.20、1.75和1.69 μg/mL，优于对照药剂啶酰菌胺（2.21 μg/mL）。
表2 目标分子对植物病原真菌的抑菌活性
以噻呋酰胺和啶酰菌胺为阳性对照，测定了分子E1在100 μg/mL时对水稻纹枯病菌的活体防治效果，发现分子E1对水稻纹枯病的活体防治效果达到了为70.8%，优于啶酰菌胺（55.7%）。通过扫描和透射电镜观察菌丝形态得知，目标分子E1能显著降低菌丝在培养基表面上的生长密度，急剧增加线粒体在菌丝细胞质中的数量，这与啶酰菌胺处理水稻纹枯病菌后菌丝出现的现象相同（图6）。随后进行的SDH酶活力测试表明，分子E1对水稻纹枯病菌SDH的IC50值达到了3.29 μM，其活性显著优于啶酰菌胺（7.90 μM）。菌丝细胞形态学观察和SDH酶活力测试表明，真菌体内的SDH是活性分子E1的潜在作用靶标。最后，申请人通过分子对接技术探究了分子E1与SDH（PDB code: 2FBW）的潜在作用方式，对接结果显示分子E1和SDH发生作用的方式与啶酰菌胺相类似（见图7）。
图6 扫描和透射电镜观察菌丝形态
图7 分子E1和啶酰菌胺与琥珀酸脱氢酶的分子对接图
三、案例创新突破
（一）主要创新内容
上述案例内容来源于申报人的科研课题，尝试将分子类药性分析、分子对接等人工智能模块应用于杂环酰胺肟醚类SDHIs分子的创制过程，从近千个假想的分子中精准筛选出了24个潜在高活性分子。分子类药性分析、分子对接等人工智能模块的引入显著提高了目标化合物设计的精准度，减小合成的工作量，为课题组节省了大量的人力、物力和财力。
（二）技术突破内容
利用FungiPAD人工智能板块对所设计的目标分子的类药性进行评价以初步减少化合物的合成数量。随后再与Autodock和Vina等人工智能板块联合使用，虚拟筛选出能与蛋白靶标有较高结合效果的分子，通过结合势能初步获得具有潜在高活性的目标分子。FungiPAD人工智能板块的引入不仅能有效减少虚拟筛选耗费的时间，还能显著增加虚拟筛选的精准度，这能为基于靶标结构的分子设计提供重要的借鉴与参考。通过上述案例的学习，能使同学们对基于靶点结构的药物创制产生兴趣，熟悉虚拟筛选的思路和方法，了解了类药性分析和分子对接的操作过程。培养了学生将所学知识灵活运用于药物研发的能力，以及根据具体药物研发案例对问题进行有效分析和评价，进而获得解决方案及有效结论的能力。
四、推广价值
申报人将该案例所涉及的人工智能模块应用于的科研项目，已成功获批1项国家级自然科学基金青年项目（32202334）、1项江苏省高等学校自然科学基金面上项目（22KJB210009），在Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊发表SCI论文3篇。
获批相关项目：
1）靶向SDH的新型吡唑酰肼衍生物的设计合成及抗小麦赤霉病菌活性研究，国家自然科学基金青年项目，2023.01~2025.12，在研，主持。
2）靶向SDH的新型吡唑酰胺肟醚类化合物及抑菌构效关系研究，江苏省高等学校自然科学研究面上项目，2022.07~2024.06，结题，主持。
发表相关论文：
1）王晓斌, 董雪, 王瑞颖, 张娟, 王濛琪, 张宗群, 杨婷玉, 许梦寒. 新型吡唑乙酰胺类琥珀酸脱氢酶抑制剂的设计、合成及抑菌活性. 高等学校化学学报, 2024, 45, 20230444.
2）Chai Jianqi, Wang Xiaobin, Yue Kai, Hou Shuaitao, Jin Fei, Liu Yv, Tai Lang, Chen Min, Yang Chunlong. Design, synthesis, antifungal activity, and action mechanism of pyrazole-4-carboxamide derivatives containing oxime ether active fragment as succinate dehydrogenase inhibitors. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72, 11308–11320.
3）Wang Xiaobin, Wang Mengqi, Han Ling, Jin Fei, Jiao Jian, Chen Min, Yang Chunlong, Xue Wei. Novel pyrazole-4-acetohydrazide derivatives potentially targeting fungal succinate dehydrogenase: Design, synthesis, three-dimensional quantitative structure-activity relationship, and molecular docking. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69, 9557–9570.
五、其他相关情况
支撑材料1：靶向SDH的新型吡唑酰肼衍生物的设计合成及抗小麦赤霉病菌活性研究, 国家自然科学基金青年项目, 2023.01~2025.12, 在研, 主持.
支撑材料2：靶向SDH的新型吡唑酰胺肟醚类化合物及抑菌构效关系研究, 江苏省高等学校自然科学研究面上项目, 2022.07~2024.06, 结题, 主持.
支撑材料3：王晓斌, 董雪, 王瑞颖, 张娟, 王濛琪, 张宗群, 杨婷玉, 许梦寒. 新型吡唑乙酰胺类琥珀酸脱氢酶抑制剂的设计、合成及抑菌活性.高等学校化学学报, 2024, 45, 20230444.
支撑材料4：Chai Jianqi, Wang Xiaobin, Yue Kai, Hou Shuaitao, Jin Fei, Liu Yv, Tai Lang, Chen Min, Yang Chunlong. Design, synthesis, antifungal activity, and action mechanism of pyrazole-4-carboxamide derivatives containing oxime ether active fragment as succinate dehydrogenase inhibitors. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72, 11308–11320.
支撑材料5：Wang Xiaobin, Wang Mengqi, Han Ling, Jin Fei, Jiao Jian, Chen Min, Yang Chunlong, Xue Wei. Novel pyrazole-4-acetohydrazide derivatives potentially targeting fungal succinate dehydrogenase: Design, synthesis, three-dimensional quantitative structure-activity relationship, and molecular docking. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69, 9557–9570.
